楚宗丽 李亮杰 姬虹 程琴 孙君艳
摘要：为研究小麦Hsp70蛋白的相互作用，利用生物信息学方法，在全基因组范围内对小麦Hsp70基因家族进行鉴定，并进行蛋白互作及可视化分析。结果表明，在全基因组范围内共鉴定到21个结构域高度保守的Hsp70基因家族成员，亚细胞定位显示主要分布于细胞质，蛋白的二级结构中，α-螺旋与无规卷曲类型在每个蛋白中所占比重较大，二者之和大于70%，延伸链和β-转角所占比重较小，二者之和小于30%。互作分析结果表明，TaHsp70-14、TaHsp70-6、TaHsp70-12、TaHsp70-16、TaHsp70-3，TaHsp70-8、TaHsp70-21、TaHsp70-20，TaHsp70-17和TaHsp70-11之间有相互作用，GO分析显示所鉴定基因主要在分子功能、生物过程及细胞成分方面起作用。
关键词：小麦;Hsp70;热激蛋白;基因鉴定;蛋白互作
中图分类号：S512.101 文献标志码：
A
文章编号：1002-1302（2022）10-0037-07
小麦（Triticum aestivum L.）属禾本科（Gramineae）麦属（Tritium），是我国重要的粮食作物之一，高产优质对保证国家粮食安全和社会稳定具有重要意义。在小麦栽培中，常遭受低温、高温、水涝和干旱等非生物胁迫[1]，这些胁迫会导致生物膜破坏和蛋白质的破坏，植株生理代谢发生紊乱，限制植株生长，严重影响小麦的产量和品质[2-3]。
植物在进化过程中形成了一系列应对机制来响应逆境胁迫[4]，热激蛋白（heat shock proteins，Hsps）是植物由不同逆境胁迫（如高温、干旱、寒冷、重金属、过氧化和各种病原体攻击等）诱导产生的一类分子伴侣类型的应激蛋白[5]，在逆境下大量表达，在植物适应环境及抵御逆境中发挥重要作用[4，6]。Hsps广泛存在于原核细胞和真核细胞中，具有高度的保守性[7]。在正常的生长发育中，它们负责蛋白质的折叠、组装、易位和降解，具有穩定蛋白质和膜的功能，并可在应激条件下协助蛋白质折叠[6]，维持细胞稳定，在调控动物、植物代谢和信号传导等方面发挥作用[8-9]。
Hsps既是植物的应激蛋白，又是必需蛋白，通常存在于植物的细胞质、线粒体、叶绿体、内质网等部位[10]，根据分子量的不同，可分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和sHSP 5个家族[5]，这些不同家族的Hsps在不同作物中已经被鉴定和研究[11-14]。Hsp70是真核细胞里最丰富的热激蛋白之一，其表达水平受外界环境条件影响，拟南芥幼苗在生长温度发生急剧变化条件下HSP70家族基因的表达水平迅速增加[9-10]，在40 ℃高温胁迫下水稻Hsp70基因在极短时间内显著表达[15]，40 ℃热激小麦幼苗后，TaHSP70在黄化幼苗叶片中的表达增加，但在绿色幼苗中保持稳定，并且在与小麦条锈病的不亲和和亲和互作过程中差异表达[16]，TaHSP70表达能被高温处理、条锈菌和白粉菌侵染所诱导[17-18]，说明在植物抗逆、抗病方面发挥着各种胁迫保护作用。HSP70基因家族在水稻[19]、玉米[20]、甘蔗[21]、辣椒[22]、铁皮石斛[23]等作物中进行了鉴定与分析，Hsp70家族在小麦的逆境等植物中已有研究[23]，但小麦基因组庞大，品种多，抗逆育种是一个复杂的工作，Hsp70基因家族分析研究仍需不断深入。因此，本研究利用小麦基因组数据库资源，对小麦Hsp70基因家族进行全基因组鉴定，并分析其理化性质、蛋白互作关系，以期为小麦Hsp70基因的功能研究提供信息参考，为小麦抗性育种提供依据。
1 材料与方法
1.1 注释基因组序列获取与Hsp70基因家族鉴定
从Ensembl Plants数据库（http：//plants.ensembl.org/）中获取小麦基因组数据，下载小麦Hsp70的cds序列、DNA序列、蛋白质序列、基因组注释信息gff3文件。从Pfam（http：//pfam.xfam.org/）数据库中下载Hsp70的隐马尔科夫模型（Hidden Markov Model，简称HMM）文件，Pfam编号为PF00012。使用拟南芥和水稻Hsp70蛋白质序列进行BLASTPP搜索。使用Hummer Search 3.0软件，在小麦基因组序列中通过隐马尔科夫模型比对，筛选小麦中含有Hsp70结构域的蛋白质序列搜索。将上述方法筛选到的候选基因蛋白质序列合并，利用SMART、NCBI-CDD数据库和Pfam对候选蛋白序列进行检测，去掉不含有Hsp70保守结构域或保守结构域不完整序列和冗余序列，得到小麦Hsp70结构域高度保守的蛋白成员。
1.2 小麦Hsp70的亚细胞定位和染色体定位
利用生物信息学在线分析软件PSORT （https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）预测小麦Hsp70蛋白的亚细胞定位，TBtools （http：//www.tbtools.org/）进行Hsp70基因的染色体定位与基因结构分析。
1.3 小麦Hsp70蛋白的保守基序motif分析和蛋白二级结构分析
利用在线工具MEME（http：//meme-suite.org/）进行小麦Hsp70蛋白序列中保守基序分析（motif），SOPMA（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htm;/）进行蛋白的二级结构分析。
1.4 小麦Hsp70蛋白互作网络分析及可视化
将上述得到的小麦Hsp70蛋白序列利用string数据库（https：//string-db.org/）以拟南芥Hsp70蛋白模型构建小麦Hsp70的蛋白互作网络。
1.5 小麦Hsp70基因成员的基因本体GO分析
基因本体（gene ontology）论分析即GO分析，是基因按功能进行富集分析的重要平台，其包括生物学过程（biological process），细胞成分（cellular component），分子功能（molecular function）三大类。首先将小麦Hsp70编码的蛋白氨基酸残基序列与拟南芥参考蛋白序列数据库进行Blast比对，获得对应的参考序列，然后把参考序列对应的基因IDmapping到AmiGO数据库中（（http：//amigo.geneontology.org），从而获得小麦Hsp70基因成员对应的GO条目，设置e-value<10-5。
2 结果与分析
2.1 小麦Hsp70基因成员的筛选鉴定及亚细胞定位
HMM模型和本地BLAST 2种搜索比对，从小麦全基因组中获得109个Hsp70候选基因，Pfam和SMART、NCBI-CDD等在线网站对筛选，舍去不含有Hsp70蛋白结构域或保守结构域不完整的序列，鉴定到21个小麦Hsp70（TaHsp70）家族成员（表1）。亚细胞定位结果显示，小麦Hsp70蛋白主要位于细胞质。
2.2 小麦Hsp70基因成员的染色体定位
为明确Hsp70基因在染色体上的位置情况，数据分析和利用TBtools（http：//www.tbtools.org/）进行染色体定位结果显示，小麦Hsp70在小麦12条染色体上呈不均等分布，1A、2B、4D染色体分别有3个Hsp70基因基，2D、3B、4B染色体上分别有2个Hsp70基因，2B、4A、5A、5B、5D、6A染色体都只有1个Hsp70基因（图1）。
2.3 小麦Hsp70蛋白的保守基序分析
利用在线工具MEME（http：//meme-suite.org/）对小麦Hsp70蛋白序列进行Motif保守元件的预测分析，搜索10个不同的保守基序，命名为Motif1-Motif10 （图2）。Hsp70一般含有5～10个保守基序，其中motif 2（18/21）、motif 4（17/21）、motif 9（17）、motif 8（16）、motif 10（16）、motif 7（15）、motif 5（15）、motif 1（15）和motif 3（15）出現的频率较高，motif 6出现频率最低，为9次。其中第1条和第4条，第6～9条，第11～13条，第17～18条都具有相同的基序数量和顺序。
2.4 小麦Hsp70的蛋白二级结构分析
利用在线软件SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）对TaHsp70蛋白进行二级结构分析。结果表明，Hsp70蛋白α-螺旋与无规螺旋卷曲的占比较大，二者之和大于70%，延伸链和β-转角类型的氨基酸所占比重较小，二者之和小于30%（图3、表2）。
2.5 小麦Hsp70蛋白互作网络分析及可视化
利用string数据库（https：//string-db.org/），进行小麦Hsp70蛋白的互作分析。结果显示，TaHsp70-14、TaHsp70-6、TaHsp70-12、TaHsp70-16、TaHsp70-3，TaHsp70-8、TaHsp70-21、TaHsp70-20，TaHsp70-17、TaHsp70-11共10个蛋白参与互作，存在35条互作关系（图4）。其中线条颜色越深，互作强度越强，线条颜色越浅，互作强度越弱。为了探究其相关功能，进一步做基因本体论分析。
2.6 小麦Hsp70基因成员的基因本体分析
基因本体注释可实现与基因有关的数据库挖掘、转化和整合，利用Blast2GO对小麦Hsp70基因家族进行分析，设置e-value<10-5，结果表明，在生物过程方面，主要集中于应激反应、胁迫反应、热反应、无机反应、多组织过程、蛋白质折叠、对金属离子的反应、对细菌的反应、先天免疫反应等。在细胞成分方面，主要集中于细胞质、细胞内膜、细胞核内发生反应。在分子功能中，主要集中于杂环化合物的结合、离子结合、ATP结合、药物结合、蛋白结合等（图5）。
3 讨论与结论
蛋白质是生命的物质基础，也是生命活动的主要承担者，Hsps是生物体在受到胁迫时的一种应激蛋白，广泛存在于各种生物体内，参与细胞信号转导、增殖、凋亡等过程[24]，其中Hsp70是提高植物高温耐受力的重要因子之一，在植物生长及抵御多种非生物胁迫中发挥作用[17，25-26]。随着基因组学的快速发展随着植物基因组测序的逐渐完成，Hsps及Hsp70家族在拟南芥[10]、玉米[20]、水稻[19]、大麦[12，27]、葡萄[28]、烟草[29]等多种植物中进行了全基因组范围内鉴定和逆境条件下的表达分析研究，亚细胞定位主要位于细胞质，结构域高度保守[5]。
小麦Hsps家族基因进行了鉴定、克隆和表达[5]，本研究在全基因组范围内对小麦Hsp70基因家族进行鉴定，共内鉴定到21个结构域高度保守的Hsp70基因家族成员，不均等分布在12条染色体上，对蛋白进行亚细胞定位分析，结果显示主要分布于细胞质，结构域高度保守，与前人研究结果[5]一致。蛋白质二级结构分析显示，α-螺旋与无规卷曲类型在每个蛋白中所占比重较大，二者之和大于70%，延伸链和β-转角类型的氨基酸所占比重较小，二者之和小于30%。
研究发现，蛋白质通过互相作用发挥生物功能[30]，蛋白互作分析及可视化分析结果表明，TaHsp70-14、TaHsp70-6、TaHsp70-12、TaHsp70-16、TaHsp70-3、TaHsp70-8、TaHsp70-21、TaHsp70-20、TaHsp70-17、TaHsp70-11共10个蛋白参与互作，存在35条互作关系。GO分析结果表明，所鉴定基因主要在分子功能、生物过程及细胞成分方面起作用。在生物过程方面，主要集中于热反应、应激反应、抗压反应、有机反应、无机反应、蛋白质折叠、对金属离子的反应、先天免疫反应、对细菌的反应等。在细胞成分方面，主要集中于细胞质、细胞内膜、发生反应。在分子功能中，主要集中于杂环化合物的结合、离子束缚、蛋白结合、结合ATP、药物结合等。
Hsps参与植物的多种代谢过程，在植物的逆境响应起主要作用，抗性育种是小麦育种中重要课题之一。随着小麦基因组测序的完成和不断完善，为深入研究这些基因的功能以及上游和下游的调控蛋白提供了基础，对TaHsps家族的分析，为通过分子手段改良小麦的耐热性提供理论依据，TaHsp家族的功能及通过何种途径提高小麦的抗性仍需进一步研究阐明。
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