沈丽雅，潘群兴，卢凤英，董永毅，张敬峰，吴坤，刘青涛，姜平，张小飞
摘要：根据新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）特有的非结构蛋白P18基因保守序列设计1对特异性引物，建立了NDRV荧光定量RT-PCR检测方法。用该方法和普通RT-PCR方法对239份临床样品进行检测，NDRV阳性检出率分别为23.85%（57/239）和17.57%（42/239），荧光定量RT-PCR检测方法的检出率明显高于普通RT-PCR检测方法。随机取5份荧光定量RT-PCR检测方法检测的阳性的樣品用鸭胚进行病毒分离培养，经普通RT-PCR扩增和基因测序证明均为NDRV。用103.0 ELD50剂量的NDRV-SY株人工感染14日龄雏鸭，不同时间采集泄殖腔肛拭子样品，通过荧光定量RT-PCR检测方法进行排毒情况监测，结果显示，雏鸭人工感染NDRV 48 h时可以从泄殖腔检测到病毒排出，持续时间可达20 d，并发现在病毒感染后的第5 d和第10 d出现2次排毒高峰。试验结果表明，建立的NDRV荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性和较高的敏感性，可用于NDRV感染的排毒监测以及临床感染的早期诊断和流行病学调查。
关键词：新型鸭呼肠孤病毒;P18蛋白基因;荧光定量RT-PCR
中图分类号：S858.325.3文献标识码：A文章编号：1000-4440（2021）06-1481-07
Establishment of SYBR Green I fluorescence quantitative RT-PCR assay for detection of novel duck reovirus based on the gene encoding P18 protein
SHEN Li-ya1，2，PAN Qun-xing1，LU Feng-ying1，DONG Yong-yi3，ZHANG Jing-feng1，WU Kun3，LIU Qing-tao1，JIANG Ping2，ZHANG Xiao-fei1
（1.Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China;3.Jiangsu Provincial Center for Animal Disease Control and Prevention， Nanjing 210009， China）
Abstract：In order to rapidly detect the novel duck reovirus （NDRV）， the SYBR Green I fluorescence quantitative RT-PCR method was established with a pair of specific primers designed according to the conservative gene sequence of the unique non-structural protein P18 of NDRV. 239 clinical samples were detected by the fluorescence quantitative RT-PCR method and ordinary RT-PCR methods， and the positive detection rates of the samples were 23.85% （57/239） and 17.57% （42/239）， respectively. The detection rate of fluorescence quantitative RT-PCR method was significantly higher than that of ordinary RT-PCR method. Five samples were randomly selected for virus culture with duck embryo from the NDRV positive samples by the fluorescence quantitative RT-PCR method. It was proved that the five isolated viruses were NDRV by ordinary RT-PCR amplification and DNA sequencing technique. The 14-day-old ducklings were artificially infected with NDRV-SY strain at a dose of 103.0ELD50， and the cloaca swabs of these ducklings were collected for NDRV detection by this fluorescence quantitative RT-PCR at different time points. The results showed that the inoculated ducklings shed virus as early as 48 hours post inoculation， and could continue until 20 days post inoculation. In addition， two peaks of viral titers were observed at five and ten days post inoculation. Therefore， the established fluorescence quantitative RT-PCR is specific and sensitive， and can be used for the detection of NDRV， early diagnosis of clinical infection and epidemiological investigation.
Key words：novel duck reovirus;gene encoding P18 protein;fluorescence quantitative RT-PCR
鸭呼肠孤病毒病已成为危害中国水禽养殖业的重要疫病，番鸭、麻鸭、半番鸭和北京鸭均可感染呼肠孤病毒（Reovirus，RV）并发病。根据宿主和病变的差异，鸭呼肠孤病毒病分为3种主要类型，即番鸭“白点病”、番鸭“新肝病”和北京鸭“脾坏死病”，其病原分别为MDRV[1-2]、新致病型番鸭呼肠孤病毒（New pathotype of Muscovy duck reovirus，N-MDRV）[3-4]和新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）[5-6]。2017年以来该病的发生率迅速上升，主要感染1月龄以内的雏鸭，且发病率和死亡率随着日龄的减少而升高。感染NDRV使得雏鸭出现免疫抑制，往往继发一些细菌性疾病，临床上报道过大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌与NDRV混合感染的病例[7-8]。
NDRV的基因节段可分为3组，即L（大）、M（中）和S（小）共10个RNA片段，其中S组有S1、S2、S3、S4 4个基因片段[9-10]。NDRV的S1基因片段编码非结构蛋白P10、P18和σC;而MDRV的P10和σC蛋白则是由S4基因片段编码，缺少编码P18蛋白对应的基因 [11-13]，因此，非结构蛋白P18基因为NDRV特有基因。研究结果显示，在感染细胞后第6 h P18即可被检测到，表明该蛋白质为病毒感染早期表达的非结构蛋白，参与病毒的复制[14-15]。因此本研究选择NDRV P18蛋白基因为检测靶标，建立NDRV荧光定量RT-PCR的检测方法，并应用该方法检测临床送检样品和NDRV强毒株（SY株）人工感染雏鸭不同时间的排毒情况。
1材料与方法
1.1毒株、SPF鸡胚、雏鸭
新型鸭呼肠孤病毒（NDRV SY株）、鸭源禽腺病毒4型（FAdV-4，SD2016-1株）、番鸭呼肠孤病毒（MDRV，CA株）、鸭甲型肝炎病毒1型（DHAV-1，W株）、鸭甲型肝炎病毒3型（DHAV-3，SD株）、鸭坦布苏病毒（DTMUV，JS2010株）、鸭瘟病毒（DEV，AV1221株）、鸭圆环病毒（DuCV，AQ0901株）、鸭源H9亚型禽流感病毒（AIV-H9，NJ01株）由江苏省农业科学院兽医研究所保存。SPF鸭胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的SPF鸭种蛋，本实验室孵化至11日龄;雏鸭由江苏省农业科学院黄梅实验动物基地NDRV抗体阴性麻鸭所产种蛋孵化。
1.2主要試剂
Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qRT-PCR （gDNA digester plus）反转录试剂盒、Hieff qPCR SYBR Green Master Mix （High Rox Plus）荧光定量试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司，核酸提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收盒购自Axygen 公司。
1.3荧光定量RT-PCR方法的建立
1.3.1引物的设计与合成根据已发表的NDRV P18蛋白基因的高度保守区序列，利用Primer Premier 5.0引物设计软件设计一对特异性引物，上游引物（Primer-F）为5′-CTTCGTGATGTCACTCCCGC-3′，下游引物（Primer-R）为5′-CGTCGCTTGACTGGTAGGGG-3′，预期目的片段大小为366 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
1.3.2标准质粒的构建以NDRV SY株核酸为模板和NDRV P18蛋白基因特异性引物进行常规RT-PCR扩增，获得NDRV P18蛋白基因片段，将其克隆到pMD18-T载体，获得克隆质粒pMD18-P18。挑取重组菌并提取质粒进行PCR鉴定，鉴定为阳性的菌送南京擎科生物技术有限公司测序，并与GenBank中的已公布的NDRV分离株序列进行同源性比较。
1.3.3荧光定量RT-PCR方法反应条件的优化以构建的重组pMD18-P18标准质粒为模板，采用HieffqPCR SYBR Green Master Mix（High Rox）试剂盒推荐的20 μl反应体系，对退火温度（55～65 ℃）和引物量（0.1 μl、0.2 μl、0.4 μl、0.6 μl）进行优化。
1.3.4荧光定量RT-PCR方法标准曲线的建立将构建的重组pMD18-P18标准质粒按10倍梯度稀释，取1μl 1.42×103～1.42×108拷贝的标准质粒为模板，用优化后的反应体系和反应条件进行检测，以Ct值为纵坐标，以稀释的阳性标准品拷贝数常用对数为横坐标，绘制标准曲线。
1.3.5特异性试验以NDRV、FAdV-4、MDRV、DHAV-3、DHAV-1、DTMUV、DEV、DuCV、AIV-H9病毒的cDNA为模板，用优化后的反应条件进行荧光定量RT-PCR检测，检验该方法的特异性。
1.3.6敏感性试验以10倍倍比稀释（1 μl 1.42×101～1.42×107拷贝）的标准质粒为模板，用优化后的反应条件进行荧光定量RT-PCR反应，检验该方法的敏感性。
1.3.7重复性试验以同一批次提取的pMD18-P18阳性标准质粒的3个不同含量（1 μl 1.42×103～1.42×105拷贝）和不同批次提取的阳性标准质粒的3个不同含量（1 μl 1.42×103～1.42×105拷贝）为模板进行检测，计算其组内变异系数和组间变异系数。
1.3.8临床样品检测将2020年江苏省、山东省等地区鸭场送检的239份临床样品，提取核酸并反转录后，利用建立的NDRV荧光定量RT-PCR方法进行检测，同时进行常规RT-PCR方法检测[16]，比较检测结果。
1.3.9病毒分离与鉴定随机取5份荧光定量RT-PCR检测NDRV阳性的样品（脾脏或肝脏），分别用含双抗各1 000 IU的生理盐水制成1∶5匀浆，37 ℃作用1 h，冻融3次，6 000 g离心10 min，上清液用0.22 μm滤器过滤除菌，经尿囊腔途径接种11日龄SPF鸭胚5枚，每1枚0.2 ml，37 ℃孵化，24 h内的死胚弃去，每日照胚2次，取出死胚置2～8 ℃暂存，至120 h时取出剩余胚置2～8 ℃过夜。无菌收获尿囊液，按样品将收获的尿囊液混合，分别对5份鸭胚尿囊液混合样进行RT-PCR扩增和测序分析，针对NDRV特有的P18蛋白基因设计的上游引物（P18-F）为5′-ATGTCACTCCCGCCAACC-3′，下游引物（P18-R ）为5′-CAGTTGTTGATTGTAGA T-3′，预期目的片段大小为488 bp。
1.3.10人工感染雏鸭试验设置15只14日龄的健康雏鸭作为试验组，每只腿部皮下注射1.0 ml NDRV-SY株（病毒滴毒为1 ml1×103 ELD50），另设置15只14日龄健康雏鸭作为对照组，每只腿部皮下注射1.0 ml生理盐水。在攻毒后7 d，从试验组和对照组随机选择9只雏鸭进行剖检，观察病理变化。攻毒后6 h开始用无菌棉签采集雏鸭泄殖腔肛拭子样品置于生理盐水中，第1 d每隔6 h采集一次，2～3 d每隔12 h采集一次，4～30 d每天采集一次，-80 ℃保存。将采集的肛拭子样品冻融3次后经漩涡振荡，8 000 r/min离心4 min，取200 μl上清液，用试剂盒提取RNA，并反转录为cDNA，共收集到624份鸭肛拭子cDNA样品（312份为NDRV人工感染麻鸭试验组肛拭子cDNA，312份为健康雏鸭肛拭子cDNA）。用建立的荧光定量RT-PCR方法对样品cDNA进行检测，每个样品重复3次，根据Ct值和熔解曲线分析NDRV感染鸭的排毒情况。
2结果
2.1重组pMD18-P18标准质粒的构建
重组pMD18-P18标准质粒经PCR鉴定，得到1条366 bp的特异性片段，与预期目的片段大小相符（图1）。测序结果进行Blast比对，结果显示，扩增的P18蛋白基因片段与GenBank上公布的NDRV不同分离株的 S1基因片段的P18蛋白基因序列同源性高达99.7%以上，表明PCR扩增的目的基因是NDRV病毒基因组中高度保守区序列， pMD18-P18质粒构建成功。
M：DNA marker 2 000;1：pMD18-P18标准质粒;2：阴性对照。
2.2荧光定量RT-PCR反应体系及条件优化
对引物量、退火温度进行优化，最终确定NDRV实时荧光定量RT-PCR最优反应体系（20.0 μl）：Hieff qRT-PCR SYBR Green Master Mix（High Rox）10.0 μl，引物F/R（10 μmol/L）各0.1 μl，模板2.0 μl，DEPC水7.8 μl。最优反应条件为：95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s，62 ℃ 45 s，40个循环。
2.3NDRV荧光定量RT-PCR标准曲线
将标准质粒10倍梯度稀释为模板进行荧光定量RT-PCR反应，并绘制NDRV的标准曲线（图2）。结果显示，标准曲线在1 μl 1.42×103 ～1.42×108拷贝具有良好的线性关系，标准曲线的相关系数为0.998，扩增效率为90.105%。NDRV的拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式为：Y=-3.582x+36.430，其斜率为-3.582，截距为36.43。依据此表达式，已知检测样品的Ct值，便可进行准确定量。NDRV标准质粒熔解曲线峰值单一（图3），熔解温度在84.94 ℃左右。
2.4NDRV荧光定量RT-PCR检测方法的特异性
用建立的荧光定量RT-PCR检测方法对不同病毒的核酸进行检测，结果显示，只有NDRV病毒核酸有扩增曲线，判定为阳性，而FAdV-4、MDRV、DHAV-3、DHAV-1、DTMUV、DEV、DuCV、AIV-H9病毒和阴性对照均未出现特异性扩增曲线（图4）。
△Rn=每点测量的荧光强度-荧光基线强度。1：
NDRV; 2～9：
FAdV-4、MDRV、 DHAV-3、DHAV-1、DTMUV、DEV、DuCV、AIV-H9;10：
阴性对照。
2.5NDRV荧光定量RT-PCR检测方法的敏感性
用建立的实时荧光定量PCR检测10倍梯度稀释（1 μl 1.42×101～1.42×107拷贝）的阳性标准质粒。结果显示，标准质粒均出现特异性扩增，该方法最低可以检出1 μl 1.42×101拷贝的模板（图5）。
△Rn=每点测量的荧光强度-荧光基线强度。
2.6NDRV荧光定量RT-PCR检测方法的重复性
对同一批次的标准质粒3个不同含量（1 μl 1.42×103～1.42×105拷貝）和不同批次的标准质粒3个不同含量（1 μl 1.42×103 ～1.42×105拷贝）模板进行检测。结果显示，组内和组间Ct值变异系数均小于0.5% （表1）。
2.7临床样品检测结果
用建立的荧光定量RT-PCR检测方法对239份临床样品进行检测，检出阳性样品57份，检出率为23.85%;普通RT-PCR检测方法检出阳性样品42份，检出率为17.57%。临床样品检出阳性率高于普通RT-PCR检测方法，且二者的检测符合率为93.7%。说明建立的荧光定量RT-PCR检测方法比普通RT-PCR检测方法更适合NDRV临床的准确检测（表2）。
2.8NDRV病毒分离与鉴定
5份荧光定量RT-PCR检测NDRV阳性的组织样品经处理后，分别接种11日龄 SPF鸭胚各5枚，5个样品接种的鸭胚于接种后96～120 h均有1～2枚胚死亡。对每个接种样品的死亡胚和120 h存活胚尿囊液收获后混合，进行 P18蛋白基因RT-PCR扩增，5份样品的鸭胚尿囊液均扩增出488 bp目的基因片段，大小与预期结果相符（图6）。测序结果显示，扩增的目的基因与NDRV 的P18蛋白基因序列一致，表明分离的5株病毒均为NDRV。
M：DNA marker 2 000;1～5：样品1～样品5;6：阳性对照;7：阴性对照。
2.9人工感染雏鸭试验结果
NDRV SY株人工感染健康雏鸭后第7 d，从试验组和对照组中，随机选择9只雏鸭剖检。结果显示，试验组雏鸭肝脏肿大，有灰白色坏死点或出血斑;脾脏表面出现核桃皮状、小米粒至绿豆粒大小的不规则坏死灶（图7）。对照组肝、脾均无明显病变（图7）。
A：健康肝;B：坏死肝;C：健康脾;D：坏死脾。
用建立的荧光定量RT-PCR检测方法对采集的雏鸭泄殖腔肛拭子样品进行检测，得到每只雏鸭各时间段样品的Ct值，用标准曲线方程计算得出其对应的病毒拷贝数常用对数值，并计算各时间段平均值和标准差，绘制排毒规律曲线图。如图8所示，试验组NDRV SY株感染鸭从第2 d（48 h）开始排毒，随后排毒量不断增加;第5 d达到第1个排毒高峰，病毒拷贝数为1 μl 1.42×102拷贝;第6～8 d，排毒量显著减少，出现一个短暂的降低;从第9 d起感染鸭排毒量又一次增加，第10 d形成第2个小高峰，病毒拷贝数为1 μl 1.42×101拷贝;个体排毒过程一直持续到第20 d左右，对照组均未检出病毒。
48 h～7 d病毒载量为15只雏鸭肛拭子病毒拷贝数的平均值，每个样品3次重复;8～20 d病毒载量为6只雏鸭肛拭子病毒拷贝数的平均值，每个样品3次重复，结果用平均值±标准差表示，*、**表示每个时间点人工感染组病毒拷贝数与对照组之间差异达0.05和0.01显著水平。
3讨论
NDRV、MDRV和ADV都是禽呼肠孤病毒，生物学特征表现基本相同，但是临床和抗原性表现存在较大的差异[17]。NDRV可感染各种鸭，不仅能引起雏鸭发病和死亡，还能引起免疫抑制和生长发育障碍，为NDRV的防控带来极大的困难。因而，建立一种特异性强、灵敏度高的快速检测方法对准确检测NDRV十分重要。荧光定量RT-PCR检测灵敏度高于普通RT-PCR，通常高100倍以上。张博等[18]根据NDRV σB基因的序列保守区，建立了TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。以NDRV特有的非结构蛋白P18基因为检测靶基因，该基因能将NDRV与MDRV和其他禽呼肠孤病毒区别开来[11-13]。P18蛋白还是病毒感染初期就表达的蛋白，参与病毒的复制。因此，针对NDRV P18蛋白基因进行检测，有利于该病的早期诊断。
建立的荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高，最低检测限为1 μl 1.42×101拷贝的模板，与张博等[18]建立的荧光定量RT-PCR检测方法的敏感性相同;比常规的RT-PCR检测方法灵敏1 000倍[16];熔解曲线结果显示，所扩增产物的Tm值基本相同，扩增特异性好;与其他常见鸭源性病毒无交叉反应，说明该方法具有很强的特异性;组内和组间的变异系数小于0.5%，表明该方法重复性好。对临床样品的检测中发现，本荧光定量RT-PCR检测方法的阳性检出率为23.85%，高于普通RT-PCR检测方法的17.57%，且二者的检测符合率为93.7%。随机选5份经荧光定量RT-PCR检测方法检出为阳性的样品接种SPF鸭胚进行病毒分离培养，对各自收获的鸭胚尿囊液用NDRV特有P18蛋白基因序列设计的引物进行PCR扩增，均扩增出预期大小的目的基因片段，基因测序结果显示与NDRV 的P18蛋白基因序列一致，证明分离的5株病毒均为NDRV。试验结果表明，建立的荧光定量RT-PCR检测方法更适合NDRV快速诊断和流行病学调查。
NDRV SY株是由本实验室从江苏省沭阳县采集并分离鉴定的强毒株[19]。用该毒株人工感染雏鸭动物试验中，利用NDRV荧光定量RT-PCR检测方法对收集的624份鸭肛拭子cDNA样品（312份为NDRV人工感染麻鸭试验组肛拭子cDNA，312份为健康雏鸭肛拭子cDNA）进行检测。结果显示，试验组NDRV-SY株感染鸭从第2 d（48 h）开始排毒，第5 d达到第1个排毒高峰，从第9 d起感染鸭排毒量又一次增加，第10 d形成第2个小高峰，排毒期一直持续到20 d左右，这可能与NDRV在宿主体内的感染与复制有关。试验组雏鸭在攻毒后第5 d起开始出现肝脏、脾脏坏死，在攻毒后第7 d肝脏、脾脏病变最为明显，这与人工感染雏鸭排毒高峰期和变化趋势相符合。
因此，本研究基于NDRV P18蛋白基因成功建立了NDRV荧光定量RT-PCR检测方法，该方法适用于NDRV感染的排毒监测以及临床感染的快速诊断和流行病学调查。
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（责任编辑：张震林）
收稿日期：2021-03-19
基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFD0500804）;江苏现代农业（水禽）产业技术体系疾病防控创新团队项目[JATS（2020）321]
作者简介：沈丽雅（1996-），女，浙江湖州人，硕士研究生，主要从事动物传染病防治研究。（Tel）15205172927;（E-mail）823320658@qq.com
通讯作者：张小飞，（E-mail）xiaofei0804@sina.com;姜平，（E-mail） jiangp@ njau.edu.cn
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