刘敬 杨紫怡 闫伟华 刘鸿飞 杨学成
摘要：
针对传统荧光染料存在合成成本高、工艺复杂、毒副作用强等问题，本文基于一步水热法，以间苯二酚和磷酸为原料，经真空干燥箱中加热，合成了具有成本低廉、生物相容性良好的纳米级荧光染料碳量子点（carbon quantum dots，CQDs）。同时，对CQD的形貌、粒径及光学特性进行表征，并对CQD的元素、官能团及其在不同pH环境下的荧光强度进行分析，将CQDs应用于癌细胞的荧光成像。研究结果表明，制备得到的CQDs具有尺寸均一，分散性良好等特点;该量子点的荧光强度可随pH值的变化而改变，且在一定的pH值区间内，CQDs的荧光强度与pH值存在线性关系，证明该量子点可应用于对癌细胞的检测及荧光成像。该研究对临床医学中的癌细胞识别及成像领域具有重要意义。
关键词：
碳量子点; 癌细胞; 荧光成像
中图分类号：
R318.51; R318.08 文献标识码：
A
近年来，荧光成像技术发展日新月异，其在辅助治疗癌细胞领域起到关键作用[1]。传统的荧光染料大多含有苯环化合物，由于这些荧光染料合成成本高、工艺复杂、毒副作用强等因素，限制了其进一步应用，因此开发新型的荧光染料势在必行。作为一种新型的碳纳米材料，碳量子点因其水溶性好、光稳定强等性能，受到人们的关注[13]。碳量子点（carbon quantum dots，CQDs）是一类由分散的类球状碳颗粒组成的尺寸极小的纳米颗粒，粒径一般小于10 nm。2006年，Sun Y P等人[4]报道了具有独特荧光性质的CQDs，世界各地的研究人员开始对CQDs进行更深入的研究。因其具有水溶性好、光学稳定性强等众多优点，被广泛用于医学成像及荧光检测等领域[57]。Wang T Y等人[8]以半胱氨酸和半乳糖为原料，利用不同浓度的碱溶液，合成具有蓝、绿和黄三种颜色碳量子点，实验证明其具有较好的生物相容性和稳定的光学性能;Liu S等人[9]以青草为碳原料，通过水热合成法制备了具有良好水溶性的氮掺杂碳量子点，成功用于Cu2+的检测;Jiang K等人[10]以邻苯二胺、间苯二胺和对苯二胺为原料，通过水热合成法，制备出具有红、绿、蓝三色的碳量子点，并将其应用于细胞成像。尽管研究人员通过多种方式合成了CQDs，但由于合成工艺复杂、步骤繁琐、产值较低等问题，限制了碳量子点在荧光成像中的进一步应用。因此，如何找到一种既绿色环保，又简便快捷的CQDs合成方法，是整个实验中需要迈出的第一步。基于此，本实验通过简单的一步水热法，以间苯二酚和磷酸为原料，成功制备具有独特荧光性质的CQDs。利用各种表征手段，分别对CQDs的形貌、元素及官能团进行表征，结果显示所制备的CQDs尺寸均一、分散性良好。同时，通过荧光分光光度计对CQDs的光学性质进行表征，拟合出CQDs的荧光强度与pH值的线性回归曲线，并以CQDs为荧光染料，成功将其应用于对癌细胞的检测及荧光成像。该研究在临床医学成像领域意义重大。
1 实验部分
1.1 实验试剂与仪器
间苯二酚（国药集团化学试剂有限公司），磷酸（国药集团化学试剂有限公司），磷酸盐缓冲液（上海源叶生物科技有限公司），FBZ1002UP型标准试剂纯水机（青岛富勒姆集团），Lambda 950型紫外可見分光光度计（上海普利赛斯集团），XB 220A型电子天平（上海普利赛斯集团），FS5型荧光分光光度计（英国爱丁堡仪器公司）。
1.2 CQDs的合成
将0.11 g间苯二酚和10 mL蒸馏水充分混合后，加入0.1 mL磷酸并放入反应釜中，随后置于真空干燥箱加热12 h，得到橙黄色的液体，即CQDs。
1.3 CQDs的荧光特性
制备的CQDs在紫外线光下呈蓝绿色，取0.4 mL样品加入2 mL蒸馏水稀释，获得实验溶液A，在A样品中逐步加入酸（磷酸）溶液，紫外线照射下的样品颜色逐渐变绿，反之在A样品中逐步加入碱（稀氢氧化钠）溶液，紫外线照射下的样品颜色逐渐变蓝。多次制备结果相同，说明该量子点样品具有稳定的荧光特性，并且在不同酸碱度的影响下表现不同。
1.4 CQDs的荧光成像
将MCF7细胞和Hela细胞分别接种在培养皿中，经37 ℃下培养12 h。随后将培养后的两种细胞洗涤3次，并悬浮于CQDs溶液（60 μg/mL）中，经温育4 h并用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤后，用共聚焦显微镜观察细胞488 nm波长激发下的荧光成像。
2 结果与讨论
2.1 CQDs的形貌表征
CQDs的形貌表征如图1所示。由图1a可以看出，已成功制备出CQDs，纳米点状材料尺寸较小，且分布均匀，证明所制备的CQDs具有良好的分散性;由图1b可以看出，通过分析TEM图像中的100个粒子点，求得CQDs的平均横向尺寸为3.4±0.2 nm。
由图1c和图1d可以看出，所获得的CQDs是高度均匀的，其平均高度为3.19±0.85 nm，表明制备的CQDs具有少量的层状和近球形结构。
2.2 CQDs的粒径及光学特性表征
CQDs的粒径及荧光特性分析如图2所示。由图2a可知，CQDs整齐的排列在平面上，表明CQDs的粒子间高度相差较小;由图2b可知，通过荧光发射光谱研究了CQDs的光学性质，而且在不同激发波长下，通过收集220 nm和500 nm之间CQDs的荧光发射数据，发现在220～400 nm之间，CQDs的荧光强度随激发波长的增加而增加，此后继续增加激发波长，荧光强度逐渐降低，证明CQDs的最大激发波长为400 nm;由图2c可知，通过对CQDs悬浮液分别照射可见光（左）和365 nm紫外线（右），观察CQDs悬浮液的颜色，发现在可见光下，样本呈橘黄色，而经紫外照射后有明显的绿色光通路，证明合成的CQDs呈现绿色荧光。
2.3 CQDs的元素及其官能团分析
CQDs的元素及其官能团分析如图3所示。由图3a可以看出，在285，400和532 eV 3个主要峰值处，分别对应着C、N和O元素的特征峰，证明合成的材料里含有C、N和O 3种元素，考虑实验中具有尚未完全反应的底物或者含有一定的中间产物，也可能是空气中的氮元素夹杂在产物中的结果。
由图3b可以看出，C 1s的XPS光谱显示有CO、C—N和CC特征峰，证明合成的材料中C元素含有以上三种化学键;由图3c可以看出，O 1s的光谱进一步验证了CO（530.7 eV）和C—O（532.3 eV）的存在[1113];由图3d可以看出，利用傅里叶红外光谱（FTIR）对合成的CQDs进行表面官能团分析，发现在3 200～3 600 cm-1和1 654 cm-1区域的峰值，分别对应着—OH和—CO的典型振动带[1421]。
2.4 CQDs在不同pH环境下的荧光强度分析
在不同激发波长下，CQDs的荧光强度分析如图4所示。由图4a可以看出，在400 nm激发下，检测CQDs在不同pH環境中的荧光强度，发现在一定的pH值下，CQDs的荧光强度与pH值呈现出相应的线性关系。随后通过缩小pH范围，发现在pH=4.5到pH=9之间，CQDs的荧光强度随pH增加而增大;由图4b可以看出，通过对上述数据进行拟合，发现pH值在6～7.5的范围内，CQDs的荧光强度与pH呈现出线性关系，计算出R2=0.99，拟合线性回归方程为Y=346.478X-1 778.103。
正常人体的pH值是6.5～7.1，其中越靠近中间值（pH=6.8）越正常;越靠近两边，离不正常的情况越近。癌细胞的pH一般较低，属于偏酸性。鉴于癌细胞偏酸的特性，且其pH值在线性范围之内，设想在癌细胞培养中掺入所合成的CQDs，实现对癌细胞的检测及荧光成像。
2.5 CQDs应用于癌细胞的荧光成像
本实验选用MCF7细胞和Hela细胞这两种具有代表性的癌细胞进行CQDs的荧光成像实验。MCF7细胞和Hela细胞中CQDs的荧光成像如图5所示。图5a为MCF7细胞在60 μg mL-1的CQDs溶液中培育3 h后的激光共聚焦明场图像，图5d为Hela细胞在60 μg mL-1的CQDs溶液中培育3 h后的激光共聚焦明场图像。由图5a～图5c可以看出，在60 μg mL-1，将MCF7细胞与CQDs溶液中培育3 h后，经400 nm的波长激发下，细胞呈现出绿色荧光，说明CQDs己经成功进入到细胞中;由图5d～图5f可以看出，经过相同的处理，在Hela细胞中同样可以观察到绿色的荧光细胞，证明所制备的CQDs成功地应用于癌细胞检测及荧光成像。
3 结束语
本文以间苯二酚和磷酸为原料，通过一步法合成了具有荧光特性的CQDs。利用TEM、AFM、XPS和FTIR对所合成的CQDs的形貌、价态及官能团进行表征，进一步证明所合成的CQDs大小均等、尺寸均一。通过在不同pH环境下，对CQDs的荧光强度进行检测，证明在一定的pH范围内，CQDs的荧光强度与pH呈现出线性关系。利用CQDs特有的荧光性质，成功将其应用于癌细胞的检测及荧光成像。此外，利用该实验中的碳量子点荧光强度与pH值的线性关系，进一步制得可量化的荧光强度检测pH值的方法。该实验也可作为其他实验的预实验，在初步分析细胞是否癌变等领域提供了一种新的思路。
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