张艳红 彭镰心 赵钢
摘要：采用气相色谱法检测藜麦中肌醇的含量。样品用70%乙醇超声提取30 min，取上清液减压蒸发至干，加入4 mL硅烷化试剂80 ℃衍生20 min，经正己烷萃取后，经HP-5色谱柱分离，FID检测器测定，以出峰时间定性，外标法定量。结果表明，肌醇在0～20 μg/mL，肌醇的浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数r2>0.999，检出限和定量限分别为0.5 mg/100 g和1.5 mg/100 g，在3个添加水平下回收率为89.5%～102.3%，相对标准偏差为3.1%～4.9%。说明该检测方法灵敏、准确、重复性好，适用于藜麦中肌醇含量的测定。
关键词：藜麦;肌醇;气相色谱法
中图分类号：
S512.901 文献标志码：
A 文章编号：1002-1302（2021）10-0162-04
藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）属于苋科藜属一年生双子叶植物[1]，是联合国国际粮农组织（FAO）确认的唯一一种能满足人体基本营养需求的单体植物，被正式推荐为最适宜人类的完美“全营养食品”，具有“超级谷物”之美誉。它含有丰富的蛋白质、淀粉、脂肪、矿物质和维生素等常规营养成分，还含有黄酮、多酚、槲皮素、皂苷、凝集素等生物活性营养成分[2]，在抗氧化、抗癌、抗炎、降糖降脂、减肥等方面有着较为广泛的应用[3]。
肌醇，别称环己六醇，广泛存在于各种动植物和微生物体内，在荞麦、南瓜、长角豆和柑橘等农作物中均含有丰富的肌醇[4-7]。肌醇是动物和微生物的生长因子，其化学结构类似于葡萄糖，因此具有多羟基化合物所具有的化学性质[8-9]，且具有类似维生素B1和生物素的作用，它能促进脂肪代谢，降低体内胆固醇和甘油三酯水平，对脂肪肝、肝硬化和糖尿病等疾病有免疫、预防和治疗的作用[10-11]。根据GB 14880―2012《食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》要求，肌醇被允许在调制乳粉（仅限儿童用乳粉）、果蔬汁（肉）饮料（包括发酵型产品等）和风味饮料中限量添加[12]。
目前尚未发现专门针对藜麦中肌醇含量测定的相关报道和研究。有关文献报道的肌醇检测方法多适用于婴幼儿食品、乳品、饮料和保健食品等，常用的检测方法有高碘酸钾氧化法[13-14]、微生物法[15-16]、液相色谱法[4，17]、液相色谱-质谱法[18]、气相色谱法[19-21]、气相色谱-质谱法[22-23]、毛细管电泳法[24]、离子色谱法[25]等。本试验在国家标准方法的基础上[15，21]，采用硅烷化衍生法对肌醇进行衍生后，采用气相色谱法对藜麦中肌醇的衍生物进行定性定量分析，通过对前处理及衍生方法进行考察，并进行系统性的方法学验证，建立了一种准确可行的藜麦中肌醇的气相色谱测定方法，以期为藜麦中肌醇的检测提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验仪器、试剂和材料
7890B气相色谱仪：带FID检测器，美国Agilent公司;CP224S电子天平：德国Sartorius公司;Allegra 64R离心机：美国Beckman Coulter公司;旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂;KQ5200B型超声波仪：昆山市超声仪器有限公司;恒温热水浴槽：北京中兴伟业仪器有限公司。
肌醇标准品（≥99%）：美国Sigma-Aldrich公司;正己烷：美国Fisher公司;无水乙醇、N，N-二甲基甲酰胺：北京迪马科技有限公司;三甲基氯硅烷：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司;六甲基二硅胺烷：瑞士Fluka公司。
测试样品藜麦购买于成都家乐福超市，分别为晨亿、众恬、尚贡、仓天然和 CASA VERDE GOURMET共5个品牌的藜麦米。
1.2 肌醇含量测定方法
1.2.1 色谱条件和系统适应性试验 色谱柱：HP-5（30 m×0.32 mm，0.25 μm）;氮气流速：1.0 mL/min;进样口温度：280 ℃;检测器温度：300 ℃;进样体积：1.0 μL;进样模式：分流;分流比：10 ∶ 1;温度程序：120 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 升温至280 ℃，保持5 min。检测器：氢火焰离子化检测器（FID）。在上述色谱条件下，肌醇保留时间为11 min左右，且达到峰形对称，分离良好，标准溶液图谱和藜麦样品中肌醇代表性图谱见图1和图2。
1.2.2 溶液配制 肌醇标准溶液：称取100 mg（精确到0.1 mg）经过105 ℃烘干2 h的肌醇标准物质于100 mL容量瓶中，用70%乙醇溶解并定容至刻度，混匀，配制成 1.0 mg/mL肌醇标准储备液，4 ℃ 条件下保存。取1 mL肌醇标准储备液用70%乙醇定容至100 mL，得到浓度为10 μg/mL的标准工作液。硅烷化试剂：分别吸取体积比为 1 ∶ 2 ∶ 8的三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、N，N-二甲基甲酰胺，混匀，临用现配。
1.2.3 样品前处理 （1）试验处理。称取试样2 g于25 mL容量瓶中，加入2/3体积70%乙醇溶液，超声提取30 min，用70%乙醇定容至刻度，混匀，过滤。取过滤后溶液5 mL于旋转蒸发瓶中。（2）衍生。向浓缩瓶中加入10 mL无水乙醇，在 80 ℃ 水浴旋转浓缩至近干时再加入5 mL无水乙醇继续浓缩至彻底干燥。向浓缩瓶中加入4 mL硅烷化试剂，溶解后转移至有螺纹盖的离心管中，放置于（80±2） ℃水浴锅中进行衍生反应20 min，反应后取出冷却至室温，加入10 mL水，混匀后再加入 5 mL正己烷，涡旋 2 min，离心分层后，取上层清液供气相色谱仪测定。
2 结果与分析
2.1 超声时间对肌醇含量的影响
设置超声时间为10、20、30、40、50、60 min进行含量测定试验，结果见图3。结果表明，超声时间对藜麦中肌醇含量的影响较为明显，肌醇含量随超声时间的延长而升高，当超声时间到达30 min時，肌醇含量达到最大，当超声时间大于30 min时，肌醇含量基本持平。因此，确定超声时间为30 min。
2.2 不同浓度的乙醇提取对肌醇含量的影响
试验以纯水、10%～100%乙醇（共11个浓度梯度）作为提取溶剂进行考察，结果见图4。结果表明，不同浓度乙醇对藜麦中肌醇含量的影响较小，总体看来，随着乙醇浓度的升高肌醇的含量随之增加，当乙醇浓度达到70%时，从藜麦中提取的肌醇含量达到最大，当乙醇浓度高于70%时，肌醇的含量有明显的下降。因此，选择70%乙醇作为提取溶剂。
2.3 硅烷化条件的考察
选择“1.2.2”节中的硅烷化试剂作为衍生化试剂，按照“1.2.3”节的方法对藜麦进行前处理，比较肌醇衍生物在气相色谱仪测得的峰面积，考察硅烷化试剂用量、 衍生温度和时间对藜麦中肌醇含量测
定的影响。
2.3.1 衍生剂用量的考察 选取硅烷化试剂用量分别为2、4、6、8、10 mL肌醇进行衍生反应，于80 ℃水浴中反应20 min，再加入5 mL正己烷萃取肌醇衍生物后，上机测定，得到不同条件肌醇衍生物的峰面积响应，结果见图5。结果显示，当硅烷化试剂用量为4 mL时，试样中的肌醇已经完全被衍生化，因此，选择衍生剂的用量为4 mL。
2.3.2 衍生温度的考察 选择硅烷化试剂用量为4 mL，选取衍生温度为50、60、70、80、90 ℃，衍生反应时间为20 min，结果见图5。结果表明，衍生温度在50、60 ℃时，肌醇衍生物的峰面积低于其他温度，70～90 ℃肌醇衍生物峰面积响应较高且无明显差别。有文献报道，肌醇衍生温度高于80 ℃时，才可生成化学结构稳定的六（三甲硅氧基）环己烷[26]，因此选择80 ℃作为肌醇硅烷化衍生温度。
2.3.3 衍生时间的考察 选择衍生剂用量为 4 mL，衍生温度为80 ℃，选取衍生时间为5、10、20、30、40 min，结果见图5。结果表明，随着衍生时间不断的增加，衍生物峰面积变化趋势不明显。综合考虑，确定衍生化试剂用量为4 mL，衍生温度为 80 ℃，衍生时间为20 min，该条件能满足藜麦中肌醇测定的衍生化反应。
2.4 方法学考察
2.4.1 标准曲线、检出限（LOD）和定量限（LOQ） 分别吸取0.0、0.2、0.5、2.0、5.0、8.0、10.0 mL肌醇标准工作溶液于旋转蒸发瓶中，按照“1.2.2”步骤操作，获得0～20 μg/mL肌醇标准系列溶液，在气相色谱条件下分析测定。以肌醇的浓度为横坐标（x），对应的峰面积为纵坐标（y），进行线性回归，以信号噪音比值（S/N）计算方法检出限（LOD）和方法定量限（LOQ），其中3倍S/N作为LOD，10倍 S/N 作为LOQ，结果见表1。
2.4.2 精密度试验 称取8份藜麦样品，按本试验方法进行前处理和上机测定，结果见表2。平均值为13.2 mg/100 g，RSD为2.10%。
2.4.3 加标回收试验 采用标准添加法，在样品中添加100、250、500 μg 3个浓度梯度的肌醇进行加标回收试验，每次各浓度进行3个平行试验，并重复3次，计算加标回收率和批内、批间的RSD值，结果见表3。由表3可知，方法回收率为89.5%～102.3%，批内和批间RSD值均小于10%，表明该方法具有良好的准确性和重现性。
2.4.4 实际样品测定 采用本方法对超市购买的5种不同品牌藜麦的肌醇进行含量测定，肌醇的含量分别为16.3、13.6、20.8、12.4、15.2 mg/100 g，采用该方法测定藜麦中的肌醇，能较好地进行目标物的定性和定量测定，可准确测定藜麦中的肌醇含量。
3 结论与讨论
3.1 样品前处理方法的选择
本研究分別比较了不同超声时间、不同浓度乙醇提取和不同硅烷化衍生条件，结果以70%乙醇超声提取30 min，衍生剂用量为4 mL在80 ℃条件下衍生20 min，肌醇的提取效率最高，衍生后上机测定的峰面积最大。
3.2 测定方法的选择
目前，有关文献报道的肌醇检测方法中，高碘酸钾氧化法适用于肌醇含量较高样品的检测，微生物法步骤繁琐，检测周期长，液相色谱法一般采用示差折光检测器和蒸发光散射检测器，该方法灵敏度低，且检测器类型不太常见，应用受到一定限制，液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法和气相色谱-质谱/质谱法灵敏度高，选择性好，但仪器价格昂贵，很多实验室不具备检测条件。
本研究建立了藜麦中肌醇的气相色谱测定方法，该方法检出限低、定量准确、灵敏度高、重复性好，可消除杂质对目标物的影响，各项技术指标均能满足日常藜麦分析检测要求，可为藜麦中肌醇测定提供可靠的检测方法依据。
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